本發(fā)明涉及水產(chǎn)領(lǐng)域，特別涉及一種青魚卵子的深低溫保存方法。
背景技術(shù)：
1、水產(chǎn)養(yǎng)殖在我國國民經(jīng)濟(jì)中占據(jù)著重要地位，是我國重要的農(nóng)業(yè)支柱產(chǎn)業(yè)之一，且以淡水養(yǎng)殖為主。目前通過雌核發(fā)育技術(shù)，青魚種質(zhì)資源的抗病功能在不斷迭代優(yōu)化，然而對(duì)于優(yōu)化的青魚種質(zhì)資源，當(dāng)前僅能通過成熟魚類不斷喂養(yǎng)持續(xù)傳代，須花費(fèi)大量經(jīng)濟(jì)成本和時(shí)間。深低溫保存技術(shù)可以僅保存雌核發(fā)育青魚的卵子和胚胎，實(shí)現(xiàn)大量的青魚胚胎保存。同時(shí)，不同區(qū)域的魚類種質(zhì)資源配對(duì)，遠(yuǎn)距離不同父本和母本人工雜交育種需要在不同的特定時(shí)間將父本母本收集在一起，有時(shí)會(huì)存在一定困難，對(duì)其中卵子和胚胎進(jìn)行保存，在需要時(shí)解凍進(jìn)行孵化可以有效解決遠(yuǎn)距離雜交育種、持續(xù)優(yōu)化種質(zhì)資源的問題。
2、現(xiàn)有用于雌核發(fā)育的青魚卵子和胚胎難以通過低溫保護(hù)的方式進(jìn)行長期保存，幾乎沒有實(shí)用化方法。在降溫過程中，魚類卵子和胚胎容易因?yàn)閮鼋Y(jié)的冰晶、或者由于急劇脫水而破損。此外，采用傳統(tǒng)低溫保存方法或人卵細(xì)胞保存的方法時(shí)，卵子和胚胎容易受到內(nèi)部鹽環(huán)境或者所添加的低溫保護(hù)劑毒性損傷，保存其完整性十分困難。魚類卵子相比人類卵細(xì)胞冷凍保存存在兩個(gè)難點(diǎn)，第一體積更大，在冷凍和復(fù)溫過程中的卵子內(nèi)外部溫差更大；第二，魚類卵子的大體積卵黃導(dǎo)致降溫過程中難以形成無冰晶的玻璃態(tài)，而人類卵子不存在此問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本發(fā)明旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中因冰晶損傷、脫水、低溫保護(hù)劑毒性導(dǎo)致的保存效果差的問題，以期達(dá)到保護(hù)淡水魚類優(yōu)質(zhì)種質(zhì)資源、進(jìn)行遠(yuǎn)距離跨區(qū)域優(yōu)良育種的目的。本發(fā)明提供了一種青魚卵子的深低溫保存方法。本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)的低溫保存方法保存青魚卵子（28.1%完整性）相比，本發(fā)明方法使卵子形態(tài)完整性提升至82.3%。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
3、本發(fā)明提供了冷凍保護(hù)劑，包括低溫保護(hù)劑、海藻糖和卵巢保護(hù)液；所述低溫保護(hù)劑包括dmso、乙二醇或異丙醇中的一種或多種；所述卵巢保護(hù)液包括bsa、na2hpo4、nacl、kcl、mgcl2·6h2o、cacl2、tyrosine和glycine。
4、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述低溫保護(hù)劑的體積分?jǐn)?shù)包括10%~40%。
5、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，以1?l體系計(jì)，所述卵巢保護(hù)液包括：4.11?g/lbsa，3.8?mmol?na2hpo4，118.0?mmol?nacl，12.7?mmol?kcl，0.7?mmol?mgcl2·6h2o，2.7mmol?cacl2，5.5?mmol?tyrosine和5.5?mmol?glycine，并用nahco3調(diào)節(jié)ph值至8.14。
6、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述低溫保護(hù)劑、海藻糖溶液、卵巢保護(hù)液的體積比包括（1~4）：5：（1~4）。
7、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述海藻糖溶液的濃度包括1?mol/l。
8、本發(fā)明還提供了用于魚類卵子或胚胎深低溫保存的組合物，包括生物相容性抗凍物質(zhì)、海藻酸鈉溶液和所述冷凍保護(hù)劑；
9、所述生物相容性抗凍物質(zhì)包括海藻糖、多聚糖或抗凍蛋白afp中的一種或多種。
10、本發(fā)明還提供了如下任意項(xiàng)在魚類卵子或胚胎的深低溫保存中的應(yīng)用：
11、（i）、所述冷凍保護(hù)劑；和/或
12、（ii）、所述組合物。
13、本發(fā)明還提供了魚類卵子或胚胎的深低溫保存方法，包括以下步驟：
14、步驟1、將所述組合物中所述生物相容性抗凍物質(zhì)導(dǎo)入魚類卵子或胚胎中，獲得導(dǎo)入生物相容性抗凍物質(zhì)的魚類卵子或胚胎，置于所述冷凍保護(hù)劑中所述卵巢保護(hù)液中，制得卵子或胚胎懸液；
15、步驟2、將步驟1所述的卵子或胚胎懸液和所述組合物中所述海藻酸鈉溶液混合后，滴入氯化鈣溶液中，形成細(xì)胞微球；
16、步驟3、將步驟2所述細(xì)胞微球在所述冷凍保護(hù)劑中平衡，獲得平衡后的細(xì)胞微球；
17、步驟4、將步驟3所述平衡后的細(xì)胞微球保存在液氮中，獲得冷凍玻璃態(tài)的魚類卵子或胚胎。
18、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述魚類包括青魚。
19、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟1所述生物相容性抗凍物質(zhì)的導(dǎo)入劑量包括：1~10μl。
20、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟1所述卵子或胚胎懸液的濃度包括10個(gè)/ml。
21、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述海藻酸鈉溶液的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)包括2%。
22、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟2所述卵子或胚胎懸液和所述海藻酸鈉溶液的體積比包括1:1。
23、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟3具體包括：將步驟2所述細(xì)胞微球依次于含有體積分?jǐn)?shù)10%、20%或40%的所述低溫保護(hù)劑的所述冷凍保護(hù)劑中平衡。
24、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述平衡的時(shí)間包括1?min。
25、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟4所述冷凍玻璃態(tài)的魚類卵子或胚胎的保存單元的容積小于10?ml。
26、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述深低溫保存方法還包括：步驟4獲得所述冷凍玻璃態(tài)的魚類卵子或胚胎后采用20℃~30℃加熱進(jìn)行解凍。
27、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述加熱的方式包括水浴加熱，單頻共振微波加熱或激光與水浴組合加熱。
28、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述深低溫保存方法還包括：所述冷凍玻璃態(tài)的魚類卵子或胚胎經(jīng)所述深低溫保存方法解凍后使用檸檬酸鈉溶液去除細(xì)胞微球表面的海藻酸鈉，釋放所述魚類卵子或胚胎。
29、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，步驟2所述檸檬酸鈉溶液的濃度包括0.1?mol/l~0.5?mol/l。
30、本發(fā)明包括但不限于提供了如下有益效果：
31、本發(fā)明通過顯微注射海藻糖或多聚糖等糖類，或使用深海魚類提取的抗凍蛋白（afp），減少冷凍過程中冰晶的形成，提高卵子和胚胎的存活率。使用海藻酸鈉水凝膠封裝卵子和胚胎，形成細(xì)胞球狀結(jié)構(gòu)，減少冷凍過程中的機(jī)械損傷和脫水問題。此外，本發(fā)明還通過逐步加入不同濃度的dmso或其他低溫保護(hù)劑，減少滲透壓對(duì)卵子和胚胎的損傷，在液氮中形成透明的玻璃態(tài)，避免了冰晶的形成，提高了保存效果。通過本發(fā)明所述魚類卵子或胚胎的深低溫保存方法保存的卵子形態(tài)完整性、具備吸水能力的比例達(dá)到82.3%。
1.冷凍保護(hù)劑，其特征在于，包括低溫保護(hù)劑、海藻糖和卵巢保護(hù)液；所述低溫保護(hù)劑包括dmso、乙二醇或異丙醇中的一種或多種；所述卵巢保護(hù)液包括bsa、na2hpo4、nacl、kcl、mgcl2·6h2o、cacl2、tyrosine和glycine。
2.如權(quán)利要求1所述的冷凍保護(hù)劑，其特征在于，所述低溫保護(hù)劑的體積分?jǐn)?shù)包括10%~40%。
3.用于魚類卵子或胚胎深低溫保存的組合物，其特征在于，包括生物相容性抗凍物質(zhì)、海藻酸鈉溶液和如權(quán)利要求1或2所述的冷凍保護(hù)劑；
4.如下任意項(xiàng)在魚類卵子或胚胎的深低溫保存中的應(yīng)用：
5.魚類卵子或胚胎的深低溫保存方法，其特征在于，包括以下步驟：
6.如權(quán)利要求5所述的深低溫保存方法，其特征在于，步驟3具體包括：將步驟2所述細(xì)胞微球依次于含有體積分?jǐn)?shù)10%、20%或40%的所述低溫保護(hù)劑的所述冷凍保護(hù)劑中平衡。
7.如權(quán)利要求5或6所述的深低溫保存方法，其特征在于，步驟4所述冷凍玻璃態(tài)的魚類卵子或胚胎的保存單元的容積小于10?ml。
8.如權(quán)利要求5至7任一項(xiàng)所述的深低溫保存方法，其特征在于，還包括：步驟4獲得所述冷凍玻璃態(tài)的魚類卵子或胚胎后采用20℃~30℃加熱進(jìn)行解凍。
9.如權(quán)利要求8所述的深低溫保存方法，其特征在于，還包括：所述冷凍玻璃態(tài)的魚類卵子或胚胎經(jīng)如權(quán)利要求8所述的深低溫保存方法解凍后使用檸檬酸鈉溶液去除細(xì)胞微球表面的海藻酸鈉，釋放所述魚類卵子或胚胎。
10.如權(quán)利要求9所述的深低溫保存方法，其特征在于，步驟2所述檸檬酸鈉溶液的濃度包括0.1?mol/l~0.5?mol/l。