背景技術(shù)：
1、原位轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)僅限于組織的2d表征并且覆蓋窄的深度。需要能夠在3d中對(duì)深層組織切片進(jìn)行分子輪廓分析的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本文公開(kāi)了用于檢測(cè)組織樣品中的感興趣的靶標(biāo)的方法，該方法包括：a)獲得或已經(jīng)獲得組織樣品，其中該組織樣品包含dna、非rna分子和rna，其中rna包含感興趣的靶標(biāo)；b)透化組織樣品；c)基本上降解組織樣品中的dna；以及d)向組織樣品中引入對(duì)感興趣的靶標(biāo)特異性的引物或探針，其中該引物或探針結(jié)合至感興趣的靶標(biāo)；以及e)檢測(cè)結(jié)合至感興趣的靶標(biāo)的引物或探針，從而檢測(cè)組織樣品中的感興趣的靶標(biāo)。
2、本文公開(kāi)了在組織樣品內(nèi)制備水凝膠的方法，該方法包括：a)獲得或已經(jīng)獲得經(jīng)固定的組織樣品，其中該組織樣品包含dna、非rna分子和rna，其中rna包含感興趣的靶標(biāo)；b)透化組織樣品；以及c)基本上降解組織樣品中的dna；其中在組織樣品內(nèi)形成水凝膠。
1.一種用于檢測(cè)組織樣品中的感興趣的靶標(biāo)的方法，所述方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括在所述組織樣品內(nèi)形成基質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟d)之前或之后將所述組織樣品包埋在水凝膠中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟a)、b)、c)或步驟d)之后將所述組織樣品包埋在水凝膠中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述水凝膠包含丙烯酰胺單體。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)將丙烯酰胺單體擴(kuò)散到所述組織樣品中并使它們交聯(lián)以形成聚丙烯酰胺凝膠，將所述組織樣品包埋在所述水凝膠中。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述探針是寡核苷酸探針，并且其中所述寡核苷酸探針附接至所述水凝膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述寡核苷酸探針共價(jià)附接至所述水凝膠。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述寡核苷酸探針用丙烯酰胺基部分修飾。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法，其中步驟a)的所述組織樣品包含脂質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其進(jìn)一步包括從所述組織樣品中減少或去除脂質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求10至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中從所述組織樣品中部分地、基本上或完全地去除脂質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括降解所述組織樣品中的所述非rna分子，其中所述非rna分子為蛋白質(zhì)分子。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述蛋白質(zhì)分子通過(guò)使所述組織樣品與蛋白酶k接觸而基本上被降解。
15.根據(jù)權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過(guò)使所述組織樣品與組織透化劑接觸來(lái)透化所述組織樣品。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述組織透化劑為十二烷基硫酸鈉、triton-x100、tween-20、甲醇或乙醇。
17.根據(jù)權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中在步驟b)之前固定所述組織樣品。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中通過(guò)使所述組織樣品與化學(xué)交聯(lián)劑接觸來(lái)固定所述組織樣品。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中所述化學(xué)交聯(lián)劑為甲醛、戊二醛、辛二亞氨酸二甲酯、sm(peg)12(peg化的長(zhǎng)鏈smcc交聯(lián)劑)、sm(peg)6(peg化的長(zhǎng)鏈smcc交聯(lián)劑)、sm(peg)2(peg化的smcc交聯(lián)劑)、siab((4-碘乙?；?氨基苯甲酸琥珀酰亞胺酯)、bmh(雙馬來(lái)酰亞胺基己烷)、sbap(3-(溴乙酰氨基)丙酸琥珀酰亞胺酯)、smpt(4-琥珀酰亞胺基氧羰基-α-甲基-α(2-吡啶基二硫代)甲苯)、dtssp(3,3'-二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基丙酸酯))、emch(n-ε-馬來(lái)酰亞胺基己酸酰肼)、sm(peg)24(peg化的長(zhǎng)鏈smcc交聯(lián)劑)、bmph(n-β-馬來(lái)酰亞胺基丙酸酰肼)、dtme(二硫代馬來(lái)酰亞胺基乙烷)、bmoe(雙馬來(lái)酰亞胺基乙烷)、smpb(4-(對(duì)馬來(lái)酰亞胺苯基)丁酸琥珀酰亞胺酯)、emcs(n-ε-馬來(lái)酰亞胺己?；?氧琥珀酰亞胺酯)、mbs(間馬來(lái)酰亞胺苯甲酰基-n-羥基琥珀酰亞胺酯)、磺基-emcs(n-ε-馬來(lái)酰亞胺己酰基-氧代磺基琥珀酰亞胺酯)、bs(peg)9(peg化雙(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸酯)、磺基-egs(乙二醇雙(磺基琥珀酰亞胺基琥珀酸酯))、lc-spdp(6-(3(2-吡啶基二硫代)丙酰胺基)己酸琥珀酰亞胺酯)、peg12-spdp(peg化的長(zhǎng)鏈spdp交聯(lián)劑)或其衍生物或組合。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中對(duì)所述感興趣的靶標(biāo)特異性的所述探針為掛鎖探針。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述掛鎖探針在步驟d)之后被環(huán)化。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中通過(guò)使聚合組織與連接酶接觸來(lái)使所述掛鎖探針環(huán)化。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其進(jìn)一步包括使經(jīng)環(huán)化的掛鎖探針與互補(bǔ)于所述掛鎖探針的引物接觸。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中互補(bǔ)于所述掛鎖探針的所述引物共價(jià)附接至所述水凝膠。
25.根據(jù)權(quán)利要求23至24中任一項(xiàng)所述的方法，其進(jìn)一步包括使用所述經(jīng)環(huán)化的掛鎖探針作為模板和寡核苷酸引物作為引物，使所述經(jīng)環(huán)化的掛鎖探針經(jīng)受滾環(huán)擴(kuò)增(rca)以產(chǎn)生擴(kuò)增子，其中所述擴(kuò)增子包含對(duì)應(yīng)于所述感興趣的靶標(biāo)的串聯(lián)重復(fù)序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其進(jìn)一步包括檢測(cè)對(duì)應(yīng)于所述感興趣的靶標(biāo)的所述串聯(lián)重復(fù)序列。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述組織樣品具有約20μm至800μm的厚度。
28.根據(jù)權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括基本上降解所述組織樣品中的所述非rna分子。
29.根據(jù)權(quán)利要求1至28中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述感興趣的靶標(biāo)包含突變。
30.根據(jù)權(quán)利要求1至29中任一項(xiàng)所述的方法，其中與步驟(b)的所述組織樣品相比，步驟(c)之后的所述組織樣品具有增加的光學(xué)透明度和增強(qiáng)的分子擴(kuò)散。
31.一種在組織樣品內(nèi)制備水凝膠的方法，所述方法包括：
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中非rna分子為蛋白質(zhì)，其中所述組織樣品中存在的所述蛋白質(zhì)是交聯(lián)的。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中在步驟a)之前保存所述組織樣品。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述方法包括使用化學(xué)交聯(lián)劑保存所述組織樣品。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述交聯(lián)劑為甲醛、戊二醛或其組合。
36.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述組織樣品具有約20μm至800μm的厚度。