本披露部分地涉及細(xì)胞農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。在特別實(shí)施例中，本披露涉及循環(huán)產(chǎn)生脂肪細(xì)胞的方法。更特別地，本披露的實(shí)施例涉及將脂肪細(xì)胞循環(huán)去分化為dfat細(xì)胞并且隨后將dfat細(xì)胞再分化。本文披露的系統(tǒng)和方法可以特別用于產(chǎn)生可口的仿制肉類產(chǎn)品。本披露還涉及其他商業(yè)上有價(jià)值的領(lǐng)域，包括但不限于芳香劑和風(fēng)味劑、細(xì)胞療法、化妝品、藥物發(fā)現(xiàn)、工業(yè)制造、再生醫(yī)學(xué)、可再生能源和獸醫(yī)學(xué)。

背景技術(shù)：

1、超過50％的24-39歲的美國(guó)人現(xiàn)在將自己描述為彈性素食者，使得越來越多的消費(fèi)者正在尋求肉類替代品，以支持更可持續(xù)的、環(huán)境友好的且道德的飲食。然而，大多數(shù)消費(fèi)者(彈性素食者或其他消費(fèi)者)一直不愿意完全接受肉類替代品，諸如植物性肉類替代品(pbma)，因?yàn)槔鐐鹘y(tǒng)肉類產(chǎn)品與其替代品之間的差異仍然明顯，并且高度加工的肉類替代品中冗長(zhǎng)的成分列表也會(huì)讓消費(fèi)者望而卻步。

2、感知的味道/質(zhì)地、成本、健康和可持續(xù)性是pbma客戶飲食決策的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素。重要的是，雖然大多數(shù)pbma面向素食消費(fèi)者，但素食主義者只占這樣的銷售額的2％，其余98％是想要消費(fèi)較少的肉類產(chǎn)品、但可能不愿意完全過渡到素食飲食的人。因此，pbma仍然只占肉類銷售額的1.5％。

3、培養(yǎng)肉，也稱為體外或?qū)嶒?yàn)室生長(zhǎng)的肉類，是一種有前途的技術(shù)，因?yàn)樗梢詼p少肉類生產(chǎn)所需的溫室氣體排放、土地利用和水利用。這項(xiàng)技術(shù)仍處于起步階段，并且雖然許多公司已經(jīng)展示了試點(diǎn)產(chǎn)品，但成本和擴(kuò)大規(guī)模的挑戰(zhàn)仍是商業(yè)化的障礙。另外，當(dāng)今新興的培養(yǎng)肉產(chǎn)品在生產(chǎn)期間依賴于胎牛血清(fbs)作為生長(zhǎng)培養(yǎng)基。由于必須直接從被宰牛的胎兒中收獲fbs，因此需要大量的質(zhì)量控制程序和監(jiān)管監(jiān)督來防止污染并確保符合道德標(biāo)準(zhǔn)，所以成本高昂。

4、常規(guī)肉類產(chǎn)品及其替代品之間的關(guān)鍵風(fēng)味差異是由脂肪含量導(dǎo)致的。例如，植物性肉類公司已經(jīng)嘗試使用復(fù)雜的成分混合物來模擬脂肪；然而，這種方法不能真正地模仿希望的質(zhì)地/味道，并且還導(dǎo)致配料表冗長(zhǎng)。實(shí)際上，風(fēng)味添加劑占pbma產(chǎn)品的約3％-10％，并且嘗試模仿脂肪組織經(jīng)常被認(rèn)為是pbma配方設(shè)計(jì)師所面臨的最大挑戰(zhàn)。

5、因此，需要通過向動(dòng)物脂肪組織添加改進(jìn)的替代品來增強(qiáng)pbma和其他肉類替代品的各種特性的新方法。本披露通過提供來自各種動(dòng)物物種的脂肪產(chǎn)生細(xì)胞(fat-producingcell)來滿足這種需求，所述脂肪產(chǎn)生細(xì)胞可以摻入替代性肉類產(chǎn)品中以產(chǎn)生具有更短成分列表和與傳統(tǒng)肉類產(chǎn)品一致的味道/質(zhì)地特征的令人信服的高質(zhì)量肉類替代品。本披露滿足了這種需求并且還提供了其他優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、在一方面，本披露提供了一種循環(huán)產(chǎn)生脂肪細(xì)胞的方法，所述方法包括將成熟脂肪細(xì)胞群體去分化以產(chǎn)生第一去分化脂肪細(xì)胞(dfat細(xì)胞)群體。在一些實(shí)施例中，所述方法包括在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)第一dfat細(xì)胞群體，直至達(dá)到第一靶生物質(zhì)。在某些實(shí)施例中，然后將第一靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體。所述一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)群體可以再分化，例如以形成再分化的成熟脂肪細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述方法包括將第一靶生物質(zhì)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)daft細(xì)胞再分化為再分化的成熟脂肪細(xì)胞。

2、可以將再分化的成熟脂肪細(xì)胞分成第一部分和第二部分。在這樣的實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括將再分化的成熟脂肪細(xì)胞的第一部分去分化以產(chǎn)生第二代dfat細(xì)胞，并且在培養(yǎng)基中培養(yǎng)再分化的成熟脂肪細(xì)胞的第二部分以積累靶脂質(zhì)質(zhì)量。在特別實(shí)施例中，所述靶脂質(zhì)積累為細(xì)胞體積的約90％。在特別實(shí)施例中，所述靶脂質(zhì)積累將低至細(xì)胞體積的20％。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，靶脂質(zhì)積累取決于進(jìn)料試劑的積累時(shí)間和濃度，其中細(xì)胞的脂質(zhì)積累能力為細(xì)胞體積的約15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、95％、或更多，其中具體值由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。在特別實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基包含濃度為從約4％葡萄糖(即，4g/l葡萄糖)至約20％葡萄糖(即，20g/l葡萄糖)、或從約4％至約15％葡萄糖、或從約4％至約10％葡萄糖、或從約4％至約8％葡萄糖、或約4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、或19％葡萄糖(g/l)的葡萄糖。在一些實(shí)施例中，所述培養(yǎng)基包含4.5％葡萄糖(g/l)。

3、在某些實(shí)施例中，使用再分化培養(yǎng)基。再分化培養(yǎng)基可以包含例如胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-x補(bǔ)充劑、吲哚美辛、地塞米松、羅格列酮、生物素、泛酸鹽、pparγ激動(dòng)劑、油酸鈉、麥胚凝集素、或其任何組合。

4、在一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括：i)將所述再分化的成熟脂肪細(xì)胞的至少一部分去分化以產(chǎn)生第二代dfat細(xì)胞；ii)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第二代dfat細(xì)胞，直至獲得第二靶生物質(zhì)；iii)將所述第二靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為第二代傳代培養(yǎng)的dfat細(xì)胞；以及iv)將所述第二代傳代培養(yǎng)的dfat細(xì)胞再分化為第二代再分化的成熟脂肪細(xì)胞。

5、所述方法可以進(jìn)一步包括循環(huán)地重復(fù)去分化、培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)、和再分化中的一個(gè)或多個(gè)的步驟，持續(xù)總計(jì)n個(gè)循環(huán)。在一些實(shí)施例中，對(duì)前一個(gè)緊鄰循環(huán)中再分化的再分化成熟脂肪細(xì)胞進(jìn)行每個(gè)循環(huán)中去分化的步驟。在某些實(shí)施例中，n等于再分化的成熟脂肪細(xì)胞維持增殖的能力和/或維持合成和儲(chǔ)存脂肪的能力的循環(huán)次數(shù)。在一些實(shí)施例中，n等于再分化的成熟脂肪細(xì)胞增殖的能力和/或維持合成和儲(chǔ)存脂肪的能力下降不超過約例如5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、或更多的循環(huán)次數(shù)，如由本領(lǐng)域技術(shù)人員針對(duì)其目標(biāo)使用情況確定。

6、在特別實(shí)施例中，所述成熟脂肪細(xì)胞群體從脂肪細(xì)胞或包含脂肪組織的組織外植體獲得，即，通過從脂肪細(xì)胞或組織外植體中分離成熟脂肪細(xì)胞群體。分離成熟脂肪細(xì)胞群體的步驟可以包括將脂肪細(xì)胞或組織外植體添加到容器(即，細(xì)胞培養(yǎng)容器)中的消化緩沖液中。在某些實(shí)施例中，將脂肪細(xì)胞或組織外植體在消化緩沖液中孵育例如至少約30分鐘。在一些實(shí)施例中，在孵育后，將脂肪細(xì)胞和消化緩沖液離心以產(chǎn)生在消化緩沖液上方的第一漂浮脂肪細(xì)胞層(fal)和在容器底部的沉淀組織。在特別實(shí)施例中，將消化緩沖液和沉淀組織從容器中去除，并且將第一fal懸浮在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。然后可以將第一fal和生長(zhǎng)培養(yǎng)基離心以產(chǎn)生第二fal和第二沉淀組織。在一些實(shí)施例中，離心步驟在不過濾的情況下進(jìn)行。在特別實(shí)施例中，將消化緩沖液和第二沉淀組織從容器中去除，并且將第二fal懸浮在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，其中第二fal包含成熟脂肪細(xì)胞。

7、在特別實(shí)施例中，將脂肪細(xì)胞以約1克脂肪細(xì)胞或組織外植體/3ml消化緩沖液的濃度添加到消化緩沖液中。在一些實(shí)施例中，將脂肪細(xì)胞以約0.1、0.5、1.5、2、2.5、3克或更多克脂肪細(xì)胞或組織外植體/3ml消化緩沖液的濃度添加到消化緩沖液中。在特別實(shí)施例中，消化緩沖液包含膠原酶。在一些實(shí)施例中，消化緩沖液包含0.2％-1％膠原酶、至少0.2％膠原酶、或高達(dá)1％膠原酶。在特別實(shí)施例中，消化緩沖液包含衍生自微生物發(fā)酵的膠原酶。消化緩沖液中使用的膠原酶可以基于待消化的源細(xì)胞的種類來選擇。在一些實(shí)施例中，所述源細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且所使用的膠原酶是膠原酶i、ii、或iv或具有與膠原酶iv相似的活性水平的膠原酶。在一些實(shí)施例中，所述源細(xì)胞是禽類細(xì)胞，并且所使用的膠原酶是膠原酶iv或具有與膠原酶iv相似的活性水平的膠原酶。重要的是，膠原酶iv可以在消化緩沖液中使用以消化哺乳動(dòng)物細(xì)胞和/或禽類細(xì)胞。在特別實(shí)施例中，膠原酶包括膠原酶iv(例如，來自溶組織梭菌(clostridium?histolyticum)的膠原酶iv)及其具有相似酶活性的變體。在一些實(shí)施例中，消化緩沖液包含至少0.2％膠原酶iv。在一些實(shí)施例中，消化緩沖液包含高達(dá)1％的膠原酶iv。

8、在特別實(shí)施例中，組織外植體包含從受試者提取的皮下脂肪。所述受試者可以是例如哺乳動(dòng)物、鳥類、魚類、爬行動(dòng)物、甲殼綱動(dòng)物、或兩棲動(dòng)物。在一些實(shí)施例中，組織外植體包含從多個(gè)受試者提取的皮下脂肪。在一些實(shí)施例中，所述受試者是相同物種。在一些實(shí)施例中，所述受試者是不同物種。

9、在某些實(shí)施例中，脂肪細(xì)胞包含原代哺乳動(dòng)物細(xì)胞、原代禽類細(xì)胞、原代魚類細(xì)胞、原代爬行動(dòng)物細(xì)胞、原代甲殼綱動(dòng)物細(xì)胞、原代兩棲動(dòng)物細(xì)胞、或其組合。在一些實(shí)施例中，脂肪細(xì)胞不包含或不衍生自多能干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、或未分化干細(xì)胞中的任何一種或多種。

10、在一些實(shí)施例中，將脂肪細(xì)胞去分化的步驟包括：i)將成熟脂肪細(xì)胞接種在去分化容器中，所述去分化容器具有足以完全填充所述容器的體積的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；ii)封閉所述去分化容器以產(chǎn)生缺氧環(huán)境；iii)將所述去分化容器倒置；iv)在所述倒置的去分化容器內(nèi)孵育細(xì)胞；v)允許成熟脂肪細(xì)胞粘附到去分化容器的頂板表面；以及vi)允許成熟脂肪細(xì)胞去分化為dfat細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，將細(xì)胞在倒置的去分化容器中孵育約10天，或約3、4、5、6、7、8、9、11、12、13、14天或更長(zhǎng)時(shí)間。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，如在此披露的接近10天的工藝效率是最有效的，但是對(duì)環(huán)境條件(諸如孵育溫度、溶解氣體等)的修改可以允許孵育時(shí)間處于極值或可能超過在此列出的起作用的那些孵育時(shí)間。在一些實(shí)施例中，將細(xì)胞在倒置的去分化容器中孵育數(shù)天，以足以觀察到伴隨中心脂質(zhì)積累損失的成纖維細(xì)胞形態(tài)。

11、在一些實(shí)施例中，將dfat細(xì)胞群體再分化，例如將第一靶生物質(zhì)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體或dfat細(xì)胞群體再分化為成熟脂肪細(xì)胞的步驟包括使第一靶生物質(zhì)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體或daft細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分化促進(jìn)劑(諸如胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒-x補(bǔ)充劑、吲哚美辛、地塞米松、羅格列酮、生物素、泛酸鹽、pparγ激動(dòng)劑、油酸鈉、麥胚凝集素、或其任何組合)接觸。

12、在一些實(shí)施例中，將第一靶生物質(zhì)內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體或dfat細(xì)胞再分化的步驟可以包括操縱一個(gè)或多個(gè)參數(shù)以優(yōu)先刺激再分化成熟脂肪細(xì)胞的形成。這樣的參數(shù)可以包括例如含有細(xì)胞的容器(即，培養(yǎng)容器)的內(nèi)表面的涂層的存在或性質(zhì)、培養(yǎng)環(huán)境的一種或多種機(jī)械特性(即，培養(yǎng)環(huán)境的彈性，如用例如水凝膠可控)、生長(zhǎng)培養(yǎng)基密度、生長(zhǎng)培養(yǎng)基滲透壓、生長(zhǎng)培養(yǎng)基溫度、刺激dfat細(xì)胞增殖而非脂質(zhì)產(chǎn)生的因子、以及控制非脂肪細(xì)胞分化的劑。

13、在特別實(shí)施例中，在實(shí)現(xiàn)dfat細(xì)胞的至少約70％匯合度時(shí)達(dá)到第一靶生物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，在實(shí)現(xiàn)至少約50％、60％、65％、75％、80％、85％、或更高的dfat細(xì)胞匯合度時(shí)達(dá)到第一靶生物質(zhì)。

14、在特別實(shí)施例中，如在本披露的各種方法中使用的生長(zhǎng)培養(yǎng)基僅包含食品安全組分。在一些實(shí)施例中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基不含血清。在一些實(shí)施例中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基不包含胎牛血清或新生牛血清。在一些實(shí)施例中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基是基于植物的，例如，如出版物諸如yamanaka2023(其全部披露內(nèi)容通過援引并入本文)中所述的培養(yǎng)基，其中生長(zhǎng)培養(yǎng)基是包含芥花油和/或其他生長(zhǎng)因子的配制品。在一些實(shí)施例中，無動(dòng)物產(chǎn)品的配制品從商業(yè)供應(yīng)商獲得。

15、在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)第一dfat細(xì)胞群體和/或傳代培養(yǎng)第一靶生物質(zhì)的步驟包括在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，直至分別達(dá)到第一靶生物質(zhì)或第二靶生物質(zhì)(即，培養(yǎng)容器中希望的匯合水平)。在一些實(shí)施例中，培養(yǎng)第一dfat細(xì)胞群體和/或傳代培養(yǎng)第一靶生物質(zhì)的步驟包括以至少5000-10,000個(gè)細(xì)胞/cm2的細(xì)胞濃度接種生長(zhǎng)培養(yǎng)基并孵育，直至細(xì)胞達(dá)到至少70％匯合度。在一些實(shí)施例中，以至少例如2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000個(gè)細(xì)胞/cm2的濃度接種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，和/或孵育細(xì)胞，直至它們達(dá)到約50％、55％、60％、65％、75％、80％、或更高的匯合度。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，理論上比所呈現(xiàn)的更大或更低的值在技術(shù)上是可能的，但在標(biāo)準(zhǔn)單層細(xì)胞培養(yǎng)條件下可能是低效的。在一些實(shí)施例中，接種5000-10,000個(gè)細(xì)胞/cm2。在一些實(shí)施例中，接種1000-5000個(gè)細(xì)胞/cm2。在一些實(shí)施例中，接種10,000-12,000個(gè)細(xì)胞/cm2。

16、在另一方面，本披露提供了一種通過本文披露的各種方法中的任一種產(chǎn)生的脂肪產(chǎn)生細(xì)胞系。當(dāng)脂肪產(chǎn)生細(xì)胞系是至少例如4個(gè)月大時(shí)，所述細(xì)胞系可以包含例如細(xì)胞內(nèi)體積的至少80％的總脂質(zhì)積累。在一些實(shí)施例中，脂肪產(chǎn)生細(xì)胞系包含使用本披露中提供的去分化方法產(chǎn)生的dfat細(xì)胞。

17、本披露的另外的方面包括通過本文披露的各種方法中的任一種產(chǎn)生的再分化的脂肪產(chǎn)生細(xì)胞的細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系被配置為在懸浮培養(yǎng)中存活。

18、另一方面包括一種用于食用的仿制肉類產(chǎn)品，其包含通過本文披露的任何方法產(chǎn)生的脂肪細(xì)胞，例如有效量的產(chǎn)生希望的風(fēng)味和/或質(zhì)地特征的脂肪細(xì)胞，以及替代性肉類來源，例如有效量的替代性肉類來源。在一些實(shí)施例中，所產(chǎn)生的脂肪細(xì)胞占仿制肉類產(chǎn)品的總體積或重量的高達(dá)約5％(或總體積或重量的高達(dá)約1％、2％、3％、4％、6％、7％、8％、或更高)。在一些實(shí)施例中，替代性肉類來源占肉類產(chǎn)品的總體積或重量的至少約10％(或總體積或重量的至少約15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或更高)。在某些實(shí)施例中，替代性肉類來源包括培養(yǎng)肉、植物性肉類替代品、昆蟲衍生的蛋白質(zhì)、發(fā)酵衍生的產(chǎn)品、真菌蛋白質(zhì)、或其組合。

19、在又另一方面，本披露涉及一種產(chǎn)生用于食用的仿制肉類產(chǎn)品的方法。在各種實(shí)施例中，所述方法包括i)將成熟脂肪細(xì)胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細(xì)胞群體；ii)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第一dfat細(xì)胞群體，直至達(dá)到第一靶生物質(zhì)；iii)將所述第一靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體；iv)將所述一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體再分化為再分化的成熟脂肪細(xì)胞；以及v)將所述再分化的成熟脂肪細(xì)胞與有效量的替代性肉類來源組合以產(chǎn)生所述仿制肉類產(chǎn)品。在一些實(shí)施例中，將成熟脂肪細(xì)胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細(xì)胞群體的步驟包括用膠原酶iv或與其具有相似酶活性的膠原酶消化所述成熟脂肪細(xì)胞群體。在某些實(shí)施例中，所述成熟脂肪細(xì)胞群體包含哺乳動(dòng)物或禽類細(xì)胞中的至少一種。

20、本披露的另外的方面包括產(chǎn)生脂肪產(chǎn)生細(xì)胞系的體外方法，其中所述脂肪產(chǎn)生細(xì)胞系包含dfat細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，所述方法包括將成熟脂肪細(xì)胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細(xì)胞群體，其中此步驟包括用膠原酶iv或與其具有相似酶活性的膠原酶消化所述成熟脂肪細(xì)胞群體。所述方法可以進(jìn)一步包括在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)第一dfat細(xì)胞群體，直至達(dá)到第一靶生物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，所述生長(zhǎng)培養(yǎng)基僅包含食品安全組分。在某些實(shí)施例中，所述方法包括將所述第一靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體。所述方法可以進(jìn)一步包括將所述一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體再分化為再分化的成熟脂肪細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，所述成熟脂肪細(xì)胞群體包含哺乳動(dòng)物或禽類細(xì)胞中的至少一種。

21、在另一方面，本披露包括一種更新原代細(xì)胞的無轉(zhuǎn)導(dǎo)方法。在實(shí)施例中，所述方法包括i)將成熟脂肪細(xì)胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細(xì)胞群體；ii)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第一dfat細(xì)胞群體，直至達(dá)到第一靶生物質(zhì)；iii)將所述第一靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體；以及iv)將所述一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體再分化為再分化的成熟脂肪細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，將成熟脂肪細(xì)胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細(xì)胞群體的步驟包括用膠原酶iv或與其具有相似酶活性的膠原酶消化所述成熟脂肪細(xì)胞群體。在某些實(shí)施例中，所述成熟脂肪細(xì)胞群體包含哺乳動(dòng)物或禽類細(xì)胞中的至少一種。

22、本披露的一方面涉及一種減少由原代脂肪細(xì)胞組成的細(xì)胞系的衰老的方法。在各種實(shí)施例中，所述方法包括：i)將原代成熟脂肪細(xì)胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細(xì)胞群體；ii)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述第一dfat細(xì)胞群體，直至達(dá)到第一靶生物質(zhì)；iii)將所述第一靶生物質(zhì)傳代培養(yǎng)為一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體；以及iv)將所述一個(gè)或多個(gè)傳代培養(yǎng)dfat細(xì)胞群體再分化為再分化的成熟脂肪細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，將原代成熟脂肪細(xì)胞群體去分化以產(chǎn)生第一dfat細(xì)胞群體的步驟包括用膠原酶iv或與其具有相似酶活性的膠原酶消化所述原代成熟脂肪細(xì)胞群體。在某些實(shí)施例中，所述原代成熟脂肪細(xì)胞群體包含哺乳動(dòng)物或禽類細(xì)胞中的至少一種。

23、本發(fā)明的另外的方面涉及一種用于產(chǎn)生可食用的培養(yǎng)動(dòng)物脂肪的商業(yè)上可擴(kuò)展的細(xì)胞系。所述細(xì)胞系可以包含通過本文披露的各種方法中的任一種產(chǎn)生的再分化的脂肪產(chǎn)生細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，在商業(yè)規(guī)模的生物反應(yīng)器中使用所述細(xì)胞系產(chǎn)生可食用的培養(yǎng)動(dòng)物脂肪。

24、另外的方面包括一種產(chǎn)生至少兩個(gè)dfat細(xì)胞群體的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，可以容易地實(shí)現(xiàn)子細(xì)胞的克隆群體，并且可以將這些群體重新混合以產(chǎn)生源自單個(gè)活檢的異質(zhì)dfat細(xì)胞群體?？商娲?，可以將來自單個(gè)動(dòng)物或兩個(gè)或更多個(gè)動(dòng)物上的幾個(gè)活檢的大量或克隆dfat群體組合以產(chǎn)生異質(zhì)群體。在各種實(shí)施例中，所述方法包括獲得脂肪細(xì)胞或包含脂肪組織的組織外植體，以及從脂肪細(xì)胞或組織外植體中分離成熟脂肪細(xì)胞群體。在一些實(shí)施例中，分離成熟脂肪細(xì)胞群體的步驟包括：i)將脂肪細(xì)胞或組織外植體添加到容器中的消化緩沖液中，其中所述消化緩沖液包含膠原酶；ii)在所述消化緩沖液中孵育所述脂肪細(xì)胞或組織外植體，直至實(shí)現(xiàn)均質(zhì)消化(例如，持續(xù)至少約30分鐘)；iii)將所述脂肪細(xì)胞和消化緩沖液離心以產(chǎn)生在消化緩沖液上方的fal和在容器底部的沉淀組織，其中此離心步驟不包括過濾；iv)從所述容器中去除所述消化緩沖液和沉淀組織；v)將所述第一fal懸浮在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中；vi)將所述第一fal和生長(zhǎng)培養(yǎng)基離心以產(chǎn)生第二fal和第二沉淀組織；vii)從所述容器中去除所述消化緩沖液和所述第二沉淀組織；以及viii)將所述第二fal懸浮在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，其中所述第二fal包含成熟脂肪細(xì)胞。

25、在一些實(shí)施例中，所述方法進(jìn)一步包括：ix)將成熟脂肪細(xì)胞接種在去分化容器中，所述去分化容器具有足以完全填充所述容器的體積的生長(zhǎng)培養(yǎng)基；x)封閉所述去分化容器以產(chǎn)生缺氧環(huán)境；xi)將所述去分化容器倒置；xii)將所述倒置的去分化容器孵育約10天；xiii)允許成熟脂肪細(xì)胞粘附到去分化容器的頂板表面；以及xiv)允許成熟脂肪細(xì)胞去分化為至少兩個(gè)異質(zhì)dfat細(xì)胞群體。

26、從隨后的描述中，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。